Các thiết bị cơ bản của một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào

Sơ đồ tổng quan như sau:

Các thiết bị cơ bản của một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào

Sơ đồ tổng quan như sau:

 Tùy thuộc vào cơ sở hạ tầng mà co thể bố trí các phòng khác nhau

 Có thể ghép một số phòng với nhau, không nhất thiết phải đủ 7 phòng riêng biệt.

VD: có thể gộp các phòng như trong danh mục thiết bị để tiết kiệm diện tích

Phòng rửa dụng cụ và cất nước

Phòng hấp - sấy, kho thuỷ tinh sạch

Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng mẫu

Phòng nuôi sáng, nuôi tối (2 phòng riêng biệt)

Phòng sinh hóa

Các thiết bị dụng cụ cần thiết cho một phòng nuôi cấy mô chuyên nghiệp đươc tổng kết dưới đây ( * chỉ những thiết bị không hoàn toàn cần phải có và có thể thay bằng các dụng cụ đơn giản hơn)

1. Phòng rửa dụng cụ và cất nước

Phòng rửa dụng cụ phải có bồn rửa lớn , có đường thoát nước riêng cho axit, có kệ để các thiết bị, có nguồn cung cấp ga, nước, điện và có thể không khí nén*, ống chân không *

- Xà phòng, axit HCl hoặc sulfuric.

- Máy rửa pipet*, các loại chổi cọ rửa.

- Bồn rửa dụng cụ

- Thùng đun nước nóng

- Máy sản xuất nước khử ion

- Máy cất nước 1 lần (8l/lần)

- Máy cất nước 2 lần

2. Phòng hấp – sấy, kho thuỷ tinh sạch

- Các giá kim loại để dựng các ống nghiệm khi hấp trong nồi hấp

- Nồi hấp Autoclave hoặc nồi áp suất: Nồi áp suất loại nhỏ (20-30 lít), Nồi áp suất loại lớn (70-100 lít)
- Tủ sấy 60 – 600oC(loại có dung tích lớn)

- Giấy nhôm hoặc hoặc hộp kim loại để tránh bị nhiễm trở lại sau khi đã khử

- Đồng hồ định giờ

3. Phòng chuẩn bị môi trường

- Tủ có chứa các loại hoá chất khác nhau
- Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g)
- Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g)
- pH kế
- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Tủ lạnh 100-200 l

- Tủ lạnh sâu (-20 đến -800C)

- Lò vi sóng* hay bếp đun để đun nóng môi trường khi trộn với aga

- Máy rót môi trường

- Máy trộn khi pha lượng lớn môi trường*

- Các dụng cụ thuỷ tinh trong suốt

- Bông không thấm nước

- Các dung dịch mẹ (stock, solutions)

- Màng lọc Millipore và giá đơc chịu nhiệt hoặc các phễu lọc thuỷ tinh xốp số 5

- Các hoá chất diệt khuẩn để xử lý mô thực vật: Calcium hypochlorite, Sodium hypochlorite, nước bromine, H₂O₂, HgCl₂, kháng sinh gồm Rifampicin, các polymicin và vancomycin .

            Trong phòng phải có khu vô trùng để chứa môi trưòng dinh dưỡng, nước khử trùng..

4. Phòng chuẩn bị khử trùng mẫu

- Bồn rửa và bàn để mẫu

- Bình chứa nước cất

- Các hoá chất khử trùng mẫu: xà phòng, Acolhol (ethanol) cồn 70%, chất tẩy hay sodium hypochloride NaClO, Ca – hypochloride dạng bột, Clorua thuỷ ngân HgCl_2, Tween 20.

5. Phòng cấy vô trùng

Phòng cấy vô trùng nên là một phòng nhỏ rộng từ 10-15m², có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào, kín, sàn và tường cần được lát gạch men hoặc sơn để lau chùi và khử trùng thường xuyên. Cửa phòng cấy nên là cửa kính vì trong khi thao tác cấy rất dễ bị phụt đèn cồn do đó cần phải dễ liên lạc với bên ngoài trong lúc cần thiết. Trên tường gắn đèn UV để khử trùng phòng.

- Tủ cấy vô trùng (laminar, clean Bench): tủ cấy tĩnh và tủ cấy thổi khí vô trùng. Trong tủ cấy phải có đèn trắng để dễ làm việc và có đèn UV để khử trùng trước khi làm việc

- Quạt thông gió

- Đèn tử ngoại treo tường 1,2m hoặc treo trần

- Thiết bị lọc khí.

- Giá và bàn để môi trường

- Bộ dụng cụ kẹp cấy, dao mổ, que cấy vòng, kim mũi nhọn, giấy lọc, bình đựng nước cất, đèn cồn (hoặc đèn gas), cốc đựng cồn 90⁰

- Hoá chất xử lý buồng cấy trước khi cấy: fomadehyde (formalin)40%, NH₃ 25%

- Áo choàng, mũ vải, khẩu trang

6. Phòng nuôi

            Tất cả các mẫu cấy đều được nuôi trong điều kiện nhiệt độ ánh sáng, độ ẩm, độ dài chiếu sáng, độ thông khí thích hợp. Phòng nuôi có nhiệt độ 15-300C tùy theo mẫu cấy và mục đích của thí nghiệm. Nhiệt độ phải được phân bố đều trong toàn phòng nuôi, phải có đầy đủ ánh sáng huỳnh quang và có thể điều khiển được cường độ và thời gian chiếu sáng. Phòng nuôi phải được thổi khí đồng nhất và biên độ độ ẩm được điều chỉnh từ 20-98%.

- Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux.

- Máy điều hòa nhiệt độ

- Máy lắc nằm ngang 100-200 vòng/phút

- Các thiết bị và dụng cụ nuôi cấy tế bào đơn

-Tủ ấm.

6(1) Phòng nuôi sáng: tường nên sơn màu trắng. Các giá đèn được lắp đèn ống để chiếu sáng. Trong phòng cần gắn các máy móc kiểm tra chính xác nhiệt độ, độ ẩm.

6(2) Phòng nuôi tối: để nuôi mô sẹo và các xử lí đặc biệt. Phòng cần tất cả các điều kiện như phòng sáng chỉ khác là không cần lắp đèn chiếu sáng cho cây, cửa sổ cần được che kín bằng vải đen.

7. Phòng sinh hoá

 (phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hóa, phân tử và di truyền để quan sát và thu nhận số liệu)

- Máy ảnh kỹ thuật số

- Hệ thống đèn chiếu

- Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần)

- Kính hiển vi soi ngược (độ phóng đại 1000 lần) gắn kèm camera

- Tủ hút, tủ ấm

- Cân các loại

- Máy cắt tiêu bản

- Máy đo pH

- Ly tâm lạnh

- Máy điện di, máy soi AND

- Máy PCR

- Máy sắc kí (HPLC, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng…)

- Quang phổ có dải đo từ 190-1100 nm.

- Tủ lạnh thường, tủ lạnh sâu

- Lò vi sóng

- Pipet tự động các loại

- Máy soi và chụp ảnh gel

-Các tủ đựng hóa chất, tủ hút khí độc.

            Bên cạnh phòng thí nghiệm cần có hệ thống nhà lưới và vườn ươm để trồng cây lấy nguyên liệu nuôi cấy và trồng cây tái sinh trong quá trình chọn lọc ìnvitro.

Các dụng cụ thí nghiệm bao gồm: Các dụng cụ thủy tinh có chia vạch (ống hút có chia độ, cốc thủy tinh có chia vạch, ống đong) cần thiết để pha môi trường. Ống đong có thể tích 10,20,100 và 1000ml được sử dụng để đong những chất lỏng có thể tích lớn còn ống hút có chia độ, bình định mức. Hộp lồng, ống nghiệm có nắp inox hay nilon. Bình thuỷ tinh chịu nhiệt. Các bình nuôi cấy bằng plastic có nắp.Đũa thuỷ tinh.

CÁC HÓA CHẤT DÙNG TRONG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

1. Các chất khử khuẩn mô thực vật

- Khử khuẩn buồng cấy: formaldehyde (formalin)4%, dung dịch NH3 25%

- Khử khuẩn cho người thực hiện: xà phòng, cồn900

- Khử khuẩn phòng nuôi: xà bông bột, dung dịch hypoclorit sodium 2% hoặc bằng cồn 95%.

- Khử khuẩn bình cấy và các dụng cụ khác: sulfochromate, cồn 950

- Chất diệt khuẩn xử lí mô cấy thực vật: NaOCl 1-15%, Tween20, HgCl2 0,1 –1%, HCl 0,5%, Hypochlorite calcium, Hypochlorite sodium, Nước bromine, Oxy già, Chlorua thủy ngân, Nitrate bạc, Kháng sinh (Rifampicin, các polymicin và vancomycin)

* Những dung dịch khử trùng phổ biến dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Calcium hypocholorite

- Sodium hypocholorite

- Hydrogen peroxide

- Bromine water

- Ethyl alcohol

- Silver nitrate

- Murcuric choloride

- Benzalkonium choloride

- Antibiotics

2. Môi trường để nuôi cấy mô thực vật

-Than hoạt tính

- Nước dừa

- Bột chuối: Bột chuối khô hoặc bột nghiền từ quả chuối xanh được sử dụng trong nuôi cấy mô

một số cây trồng như phong lan

- Một số hỗn hợp dinh dưỡng hữu cơ phức tạp khác: Nước cốt cà chua, dịch chiết khoai tây nghiền, dịch chiết mạch nha, dịch chiết nấm men (yeast extract), casein thuỷ phân (casein hydrolysate)

- Dịch chiết nấm men (yeast extract-YE)

- Dịch thủy phân casein (casein hydrolysate-CH)

Bảng. Thành phần một số loại môi trường dùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật

3. Các chất điều hoà sinh trưởng

a. Auxin

- 1H- indole-3-acetic acid (IAA)

- 1-naphthaleneacetic acid (NAA)

- 1H-indole-3-butyric acid (IBA)

- 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)

- Naphthoxyacetic acid (NOA)

- 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA)

- p-chlorophenoxyacetic acid (PCPA)

- 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T)

- 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA)

- 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram)

- 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba)

b. Cytokinin

- 6-benzylaminopurine (BAP)

- 6-benzyladenin (BA)

- 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP)

- N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6- amine (kinetin)

- 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin)

c. Giberellin

- Gibberellic acid GA3

- Gibberllin 1 (GA1)

- Gibberellin 4 (GA4)

- Gibberellin 7 (GA7)

d. Abscisic axít (ABA)

e. Ethylene

f. Nhóm Polyamine

- Putrescin

- Spermidine

- Sspermine

g. Jasmonic acid (Ja)

Methyl jasmonate (MeJa)

4. Các tác nhân làm rắn môi trường

- Agar

- Methacel

- Alginate

- Phytagel

- Gel-rite

• Giải pháp trang thiết bị cho công nghệ trồng nấm (06/06/2011)